25-羥基維生素 D3是維生素D3的代謝產(chǎn)物，在治療維生素D3缺陷癥、改善鈣磷代謝方面，補(bǔ)充25-羥基維生素 D3比單獨(dú)使用維生素D3更有效。此外，由于25-羥基維生素 D3在鈣磷代謝中的重要作用，其作為動(dòng)物營養(yǎng)飼料添加劑在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中具有巨大的市場需求。細(xì)胞色素P450酶 （P450s） 是生物合成 25-羥基維生素D3的有力候選催化劑，但其應(yīng)用受到穩(wěn)定性低、催化效率低和解耦反應(yīng)等限制。為解決上述限制，構(gòu)建自給自足的 P450 ，需要結(jié)構(gòu)域間linker優(yōu)化來調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域間構(gòu)象動(dòng)力學(xué)。 

　　研究首先將全細(xì)胞生物催化劑篩選與反應(yīng)條件的系統(tǒng)優(yōu)化相結(jié)合以提高催化性能。在優(yōu)化條件下，血紅素結(jié)構(gòu)域 Vdh-K1 實(shí)現(xiàn)了 91.6% 的轉(zhuǎn)化效率，隨后被選中用于嵌合酶組裝。通過采用局部能量挫折分析來評估蛋白質(zhì)柔性和變構(gòu)動(dòng)力學(xué)，鑒定了具有高阻挫 linker 的嵌合P450 突變體。最佳突變體 VK1-CYP116B46-L21 表現(xiàn)出更好的熱穩(wěn)定性、催化活性和偶聯(lián)效率，25-羥基維生素 D3產(chǎn)量為 4.89 mM （1.96 g/L），是迄今為止報(bào)道的大腸桿菌全細(xì)胞催化的最高產(chǎn)量。 

　　中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所微生物與酶工程科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)博士研究生梁子琦為論文的第一作者，涂濤研究員、姚斌院士以及西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院楊小軍教授為論文的通訊作者。該研究得到國家自然科學(xué)基金和中國農(nóng)科院重大任務(wù)等項(xiàng)目的支持。

 

　　原文鏈接：https://doi.org/10.1021/acs.jafc.4c12356